Jumat, 01 Januari 2010

ISOLASI DNA

BIOLOGI MOLEKULER

ISOLASI DNA

Pendahuluan

Isolasi DNA

DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel berinti, seperti darah, semen, rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh.

DNA genom yang diisolasi dapat digunakan untuk identifikasi DNA suatu organisme, baik dengan metode PCR (polymerase chain reaction) atau menggunakan enzim endonuklease restriksi (”DNA fingerprinting”). Hasil pemeriksaan dari kedua teknik tersebut kemudian dapat digunakan untuk diagnosis penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus atau bakteri, mendeteksi adanya mutasi gen yang menimbulkan penyakit keganasan, penyakit herediter, menentukan jenis kelamin prenatal serta sebagai alat bantu forensik dalam bidang kedokteran.

Darah (whole blood) dan sumsum tulang mamalia mengandung baik sel-sel berinti (sel darah putih) maupun sel-sel tidak berinti (sel darah merah). Untuk mengisolasi DNA dari darah dan sumsum tulang, sel darah merah yang tidak mengandung DNA genom harus dilisiskan dahulu agar dapat dipisahkan dari sel darah putih. Sel-sel darah putih yang sudah dipisahkan kemudian dilisiskan dengan bantuan bahan pengawet DNA yaitu, deterjen anionik yang dapat melarutka komponen seluler. Bahan pengawet DNA juga dapat mengurangi aktivitas Dnase yang terdapat di dalam sel. Bila perlu dapat ditambahkan Rnase untuk menyingkirkan kontaminasi RNA.

Selanjutnya dengan presiitasi garam, DNA genom dipisahkan dari protein plasma dan inti. Akhirnya DNA genom diisolasi dengan presipitasi dengan alkohol dan pelarutan kembali endapan yang terbentuk dari larutan dapar yang mengandung suatu bahan pengawet DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan baikapabila didapatkan DNA yang murni dan utuh.

Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya > dari 35 µg DNA per mL darah. Dari 150 µL sediaan, hasil DNA yang diharapkan berkisar antara 2,5 sampai 7,5 mg. DNA yang diperoleh sangat tergantung pada jumlah sel darah putih dalam sampel darah atau sumsum tulang. Jumlah sel darah putih dalam sampel bervariasi, tapi rata-rata terdapat 7 × 106/ mL darah. Setiap sel rata-rata mengandung 6 pikogram DNA. Hasil yang didapat mungkin lebih rendah, bila sampel darah dikumpulkan tanpa EDTA atau penyimpanannya tidak tepat, atau bila sampel disimpan lebih dari 5 hari sebelum digunakan dalam prosedur isolasi DNA ini.

Prinsip isolasi DNA adalah melisiskan sel, memisahkan DNA dari protein, mengendapkan DNA, melarutkan kembali DNA, menghitung jumlah DNA yang diperoleh dan menilai kemurnian DNA.

Pengukuran serapan DNA dilakukan pada panjang gelombang 260 nm (A 260). Pada A260 = 1, konsentrasi DNA adalah 50 mg/mL.

Konsentrasi DNA (mg/mL) = A260 × 50 mg/mL

Pengenceran

Kemurnian DNA ditentukan dengan indeks kemurnian. DNA dikatakan murni bila memiliki indeks kemurnian > 1,75.

Indeks Kemurnian = A260 / A280

Reaksi Polimerisasi Berantai

PCR adalah metode perbanyakan DNA secara enzimatik sehingga DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis / penelitian. DNA yan jumlahnya sangat kecil, misalnya dari beberapa sel folikel rambut juga dapat dikarakterisasi dengan metode ini. Penemuan PCR pada tahun 1986 merupakan suatu langkah revolusi dalam bidang biokimia molekuler dan rekayasa genetika. Saat ini PCR sudah digunakan secara meluas pada kedokteran forensik, diagnosis genetika dan mikrobiologis serta manipulasi dan rekayasa gen. Selain itu teknik ini juga dapat digunakan untuk menganalisis penyakit, Duchenne’s muscular dystrophy, hemofilia A, untuk mendeteksi limfoma T pada manusia, Human immunodeficiency virus (HIV), virus hepatitis B, dan retinoblastoma serta untuk membuat DNA mutan dengan situs mutasi yang spesifik.teknik ini banyak digunakan baik untuk penelitian maupun diagnosa klinik karena cukup spesifik, efesien dan memiliki derajat keberhasilan yang tinggi.

Istilah ”reaksi berantai” digunakan karena perpanjangan rantai DNA dilakukan dalam siklus yang berulang-ulang (25 hingga 35 siklus). Yang diperlukan pada reaksi PCR adalah suatu DNA sasaran yang akan diamplifikasi, sepasang oligonukleotida primer yang masing-masing komplementer dengan ujung 3’ dari salah satu untai DNA sasaran, deoksinukleotida triposfat (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP) dan suatu enzim DNA polimerase yang tahan terhadap pemanasan tinggi (dikenal dengan Taq polimerase). Taq polimerase berasal dari bakteri, Thermus aquaticus, yang dapat tumbuh pada sumber air panas bersuhu 1000C atau lebih.

Komponen dari reaksi PCR diinkubasi di dalam suatu mesin yang dapat mengatur perubahan suhu secara tepat (dikenal sebagai Thermal cycler). Tahap pertama adalah denaturasi DNA yaitu dengan cara meningkatkan temperatur hingga kurang lebih 940C selama 1 menit, sehingga terjadi pemisahan dari kedua untai DNA dupleks. Tahap kedua adalah tahap penempelan oligonukleotida primer (annealing/ hibridasi). Pada tahap ini suhu reaksi diturunkan menjadi 500C-620C (600C) selama 1 menit agar oligonukleotida dapat menempel pada DNA. Tahap ketiga adalah tahap pemanjangan rantai yaitu dengan cara memaskan kembali komponen-komponen reaksi pada suhu 720C selama 1 menit sehingga primer dapat diperpanjang oleh enzim DNA polimerase hingga mencapai seluruh panjang dari DNA sasaran. Ketiga tahap ini diulang sebanyak 25-35 kali.

Jadi, setiap DNA dupleks pada siklus pertama akan membentuk 2 untai anak sehingga seluruhnya terdapat 4 untai DNA. Selanjutnya selama siklus kedua, keempat untai ini akan berfungsi sebagai cetakan dan akan dihasilkan 8 untai DNA. Pada akhir dari siklus kedua akan terbentuk polinukleotida yang panjangnya hanya terbatas dari satu primer ke primer lainnya. Fragmen DNA ini disebut amplikon. Sklus selanjutnya akan menghasilkan penggandaan dari jumlah amplikon.

Prosedur PCR dapat memperbanyak jumlah DNA hingga beberapa juta kali. Para ilmuwan telah meramalkan bahwa teknik ini akan membawa pengaruh besardalam bidang biokimia molekuler dan genetika seperti halnya penggunaan enzim restriksi yang telah mempengaruhi biologi molekuler.

Pada variasi kelainan gen aldehid-dehidrogenase-2 (ALDH-2) dapat mempengaruhi sensitivitas seseorang terhadap konsumsi alkohol. Sensitivitas terhadap alkohol bervariasi antar ras. Pada ras kaukasus misalnya, 90%-nya tahan terhadap alkohol.

Aldehid dehidrogenase adalah salah satu enzim yang berperan penting dalam metabolisme alkohol, selain dari enzim alkohol dehidrogenase (ADH). Enzim ini mengubah aldehid menjadi asetat. Rangkaian reaksi metabolisme alkohol adalah sebagai berikut:

CH3CH2OH CH3CHO CH3COOH

ADH ALDH

Enzim ALDH terdiri dari beberapa isoenzim dan yang aktivitasnya paling penting dan paling kuat dalam metabolisme alkohol adalah ALDH-2. gangguan pada aktivitas enzim ALDH menyebabkan penumpukan aldehid dalam darah, selanjutnya aldehid yang menumpuk dapat menimbulkan kemerahan dan rasa panas pada wajah (flushing).

Enzim ALDH-2 tersusun dari 517 asam amino. Dari beberapa hasil penelitian ternyata pada individu yang tidak tahan alkohol ditemukan adanya variasi pada gen ALDH-2 yaitu nukleotida G dari kodon GAA untuk asam amino ke-487 berubah menjadi nukleotida A sehingga asam amoni ke -487 berubah dari asam glutamat (GAA) menjadi lisin (AAA). Asam amino lisin pada posisi 487 dari enzim ALDH-2 ini menyebabkan aktivitas enzim ini mejadi menurun.

Prinsip dasar PCR adalah proses replikasi DNA dengan bantuan enzim taq polimerase yang tahan pemansan tinggi dan sepasang oligonukleotida primer yang masing-masing komplementer dengan ujung 3’ dari salah satu untai DNA sasaran.

Tahap kerja dari teknik PCR adalah:

  1. Denaturasi.
  2. Penempelan oligonukleotida primer (hibridasi/annealing).
  3. Perpanjangan rantai (polimerase).

Sidik DNA (DNA Fingerprinting)

Setiap individu kecuali kembar identik, memiliki keunikan genetik, yaitu kesamaam dan perbedaan dalam urutan DNA mereka. Keunikan genetik disebabkan oleh 2 faktor, yaitu keturunan dan mutasi. Pada organisme diploid, satu genom diturunkan dari ayah dan satu dari ibu. Keunikan dari struktur DNA pada seluruh jaringan tubuh suatu organisme merupakan dasar dari pemeriksaan sidik DNA.

Bahan untuk pemeriksaan sidik DNA dapat diperoleh dari setiap bahan biologis yang mengandung DNA, seperti jaringan dan cairan tubuh, folikel rambu dan lain-lain. Analisis DNA ini juga dapat dilakukan pada bahan-bahan kering misalnya bercak dara atau jaringan yang dimurnifikasi. Pada DNA yang akan dianalisis, diberikan enzim restriksi yang akan memotong DNA menjadi fragmen-fragmen dengan panjang yang berbeda-beda. Enzim restriksi akan menempati suatu molekul DNA dan bergeser sepanjang heliks DNA hingga ia mengenali urutan pasangan basa spesifik yang memberi sinyal untuk berhenti bergeser. Kemudian enzim tersebut akan bertindak sebagai ’gunting molekuler’ yang memotong DNA pada urutan pasangan basa spesifik. Tempat urutan pasangan basa spesifik ini disebut juga situs restriksi.

Apabila pada suatu molekul DNA terdapat lebih dari situs restriksi, maka enzim restriksi aka mempotong DNA pada situ-situs tersebut sehingga diperoleh beberapa fragmen dengan panjang yang berbeda-beda. Panjang masing-masing fragmen tergantung pada lokasi situs restriksi DNA. Suatu enzim restriksi tertentu akan mengenali 4 atau 6 pasang basa tertentu pada situs restriksi. Hampir semua enzim restriksi dapat mengenali situs restriksi yang merupakan suatu palindrom. Suatu palindrom adalah pasangan urutan basa DNA, yang apabila dibaca dari arah 5’ ke 3’ maka urutan pada masing-masing untai DNA tersebut adalah sama. Misalnya AAGCTT dan TTCGAA, GAATTC dan CTTAAG, dan lain-lain. Urutan basa yang bersifat palindromik ini banyak terdapat pada sepanjang molekul DNA. Situs restriksi adalah khas untuk suatu enzim. Enzim endonuklease restriksi dapat memotong pada urutan basa spesifik yang bersifat palindrom.

Setelah dipotong oleh enzim restriksi, fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dipisahkan dengan bantuan elektroforesisgel agarosa. Elektroforesis akan memisahkan fragmen-fragmen DNA sesuai ukuran mereka. Fragmen DNA bermuatan negatif sehingga akan bergerak ke kutub positif (anoda). Matriks gel agarosa bertindak sebagai jaringan molekul sehingga fragmen DNA yang bergerak lebih jauh daripada yang besar. Fragmen-fragmen dengan ukuran yang sama bergerak bersama-sama dalam satu pita DNA. Untuk memantau mobilitas DNA pada gel, ditambahkan zat warna biru bromfenol pada larutan DNA yang akan diperiksa. Zat warna ini akan bergerak menuju kutub positif pula, mendahului fragmen DNA yang terkecil.

Sesudah elektroforesis selesai, gel direndam dalam larutan pewarna (DNA biosfe) untuk mewarnai DNA. Molekul zat warna akan terikat pada DNA yang berada pada gel tersebut. Selanjutnya gel direndam dalam air untuk menghilangkan zat warna yang ada pada gel yang tidak terikat pada DNA. Setelah pita-pita DNA terlihat, pola restriksi Dna pada tiap-tiap sampel dapat dibandingkan.

Sidik DNA merupakan alat analitik yang sangat bermanfaat untuk memeriksa kesamaan dan perbedaan antara individu yang berbeda. Pemeriksaan ini dapat digunakan untuk identifikasi kandungan makanan yang membahayakan, identifikasi bagian tubuh manusia, mempelajari hubungan antar ras, mencari keluarga anak-anak yang terpisah akibat perang, identifikasi organisme penyebab penyakit, identifikasi orang tua kandung, deteksi DNA pada tumor, menentukan keberhasilan transplantasi sumsum tulang, identifikasi pelaku kejahatan dan lain-lain.

Prosedur Kerja

* Isolasi DNA

  1. Darah (whole blood) disentrifus dan diambil lapisan buffy coat-nya.
  2. Buffy coat sebanyak 300 µL dimasukkan ke dalam ependrof dan ditambah 900 µL pelisis sel, kemudian didiamkan pada suhu kamar selama 10 menit.
  3. Darah yang telah lisis disentrifus 13.000 rpm selama 20 detik dan supernatan dibuang.
  4. Ditambahkan 300 µL pelisis inti sel (sel darah putih), divortex, dan supernatan dibuang.
  5. Darah yang inti selnya telah lisis ditambah 100 µL pengendap protein, disentrifus 13.000 rpm selama 3 menit, dan diperoleh supernatan.
  6. Supernatan yang mengandung DNA dituang ke dalam tabung reaksi yang berisi 300 µL isopropanol 100% dingin, diinvert/ dibolak-balik 50 kali. ( 1 × bolak-balik = 1 × invert), disentrifus 13.000 rpm selama 3 menit. Supernatan dibuang dan dikeringkan dengan hairdryer, DNA dijaga agar tidak hilang.
  7. Setelah kering ditambah 300 µL alkohol dingin, diinvert 50 kali dan disentrifus 13.000 rpm selama 3 menit. Supernatan dibuang dan dikeringkan dengan hairdryer, DNA dijaga agar tidak hilang.
  8. Ditambahkan 100 µL penghidrasi DNA dan diinkubasi pada suhu 650C selama 1 jam dalam waterbath.
  9. Selanjutnya dapat diidentifikasi dengan elektroforesis/ disimpan pada suhu -200C.
  10. Perhitungan jumlah DNA yang diperoleh dengan spektrofotometer:

- Kuvet diisi dengan 1 mL akuades.

- 1-5 µL DNA yang akan dihitung dimasukan ke dalam kuvet, dan dikocok perlahan.

- Serapa DNA diukur pada panjang gelombang 260 nm.

Pada A260 = 1, konsentrasi DNA adalah 50 mg/mL.

Konsentrasi DNA (mg/mL) = A260 × 50 mg/mL

Pengenceran

  1. Kemurnian DNA dapat dihitung dengan rumus:

Indeks Kemurnian = A260 / A280

DNA murni bila indeks kemurnian > 1,75

Pembahasan

Pada praktikum ini kami melakukan isolasi DNA genom yang berasal dari sample darah. Kemudian DNA murni yang dihasilkan dapat dianalisis dengan elektroforesis, ataupun dapat pula digunakan untuk keperluan lainnya, seperti PCR (Polymerase Chain Reaction) dan sidik DNA.

* Isolasi DNA Genom

DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel berinti, seperti darah, semen, akar rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh. DNA dapat diisolasi sekalipun dengan menggunakan bahan kering seperti, bercak darah maupun preparat autan, selain itu DNA juga dapat diisolasi dari produk olahan.

Pada praktikum kali ini DNA diisolasi dari sampel darah. Darah disentrifus membentuk whole blood yang terdiri dari tiga lapisan, yaitu plasma, endapan, dan buffy coat. Buffy coat merupakan lapisan sel darah yang memiliki inti sel, seperti halnya sel darah putih. Pada saat pemipetan lapisan buffy coat, endapan tidak boleh ikut terbawa karena dapat mengganggu jalannya proses isolasi DNA.

Lapisan buffy coat ditambahkan larutan pelisis sel. Perbandingan darah dengan larutan pelisis sel yaitu 1 : 3, bila menggunakan 300 µL darah (buffy coat) memerlukan 900 µL larutan pelisis sel. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel darah merah yang tidak mengandung DNA genom, agar sel darah putih yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari sel darah merah. Setelah itu, campuran darah dan pelisis sel didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit, agar reaksi berjalan sempurna serta keduanya dapat bercampur homogen. Kemudian dapat disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 20 detik, dan supernatannya dibuang. Sebagaimana telah diketahui, DNA genom terdapat di dalam kromosom, dan benang-benang kromosom terdapat dalam inti sel baik haploid (n) pada sel kelamin/ sel gamet maupun diploid (2n) pada sel tubuh/ dikenal dengan sel somatis. Kromosom sel tubuh berjumlah 46, sedangkan pada sel kelamin jumlahnya hanya 23.

Darah yang telah lisis (hemolisat) ditambahkan larutan pelisis inti sel yang merupakan bahan pengawet DNA sebanyak 300 µL, guna melisiskan inti sel darah putihnya. Bahan pengawet DNA merupakan deterjen anionik yang berguna untuk melarutkan komponen seluler, seperti halnya tween-20. Bahan pengawet DNA juga dapat mengurangi aktivitas DNase yang terdapat dalam sel.Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang kita inginkan ada di dalamnya. Biasanya tidak diperlukan proses inkubasi, namun apabila gumpalan sel masih terlihat setelah proses pencampuran, perlu dilakukan inkubasi pada suhu 370C atau pada suhu ruang hingga larutan homogen. Sampel yang disimpan pada suhu ruang dapat tetap stabil, selama sekurang-kurangnya 18 bulan. Kemudian divortex, guna mempercepat proses pelisisan inti sel, dan supernatannya dibuang.

Setelah ditambahkan pelisis inti sel, dapat pula ditambahkan RNase. Sedangkan RNase berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA. Biasanya larutan RNase A ditambahkan ke dalam lisat sel, kemudian diinvert 50 kali dan diinkubasi pada suhu 370C selama 15 menit. Tetapi karena tahap ini kurang begitu berarti dalam isolasi DNA sehingga tidak dilakukan pada praktikum kami.

Selanjutnya adalah tahap pengendapan protein. Protein yang terdapat dalam lisat sel diendapkan dengan penambahan larutan pengendap protein sebanyak 100 µL, kemudian divortex selama 20 detik sehingga pengendap protein dan lisat sel dapat bercampur secara menyeluruh. Selanjuntnya masuk ke proses sentrifus, dengan kecepatan sentrifugasi 13.000 rpm selama 3 menit. Endapan protein akan membentuk butiran coklat tua yang padat.

Tahap berikutnya adalah tahap pengendapan DNA. Supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi pengendapan protein mengandung DNA dan selanjutnya dituangkan secara hati-hati ke dalam tabung yang berisi 300 µL isopropanol 100% (dingin). Endapan protein dapat dibuang. Penambahan isopropanol dingin bertujuan untuk mempercepat reaksi pengendapan/ presipitasi DNA genom. Kemudian tabung diinvert/ dibolak-balik ( 1 × invert = 1 × bolak-balik) sebanyak 50 kali secara perlahan, hingga terlihat adanya benang-benang putih DNA yang membentuk gumpalan. Setelah itu disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit, DNA akan tampak sebagai butiran putih kecil, dan supernatan dibuang. Tabung dikeringkan pada suhu ruang sampai kering, atau dapat pula dikeringkan dengan hairdryer/ alat pengering rambut. Bila melakukan proses pengeringan dengan cara yang kedua, harus lebih hati-hati, agar DNA tidak hilang. Selanjutnya butiran DNA genom dicuci dengan penambahan alkohol 70% (dingin) sebanyak 300 µL, diinvert kembali sebanyak 50 kali agar proses pencucian sempurna, kemudian disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit dan supernatannya dibuang. Etanol dituang dengan hati-hati tanpa mengeluarkan butiran DNA. Tabung selanjutnya dapat dikeringkan dengan alat pengering rambut selama 15 menit atau sampai tabung kering.

Tahap selanjutnya adalah tahap menghidrasi DNA. Larutan penghidrasi DNA sebanyak 100 µL ditambahkan ke dalam tabung berisi butiran DNA. DNA genom dipanaskan pada suhu 650C selama 1 jam atau dapat pula dibiarkan mengalami rehidrasi selama semalaman pada suhu ruang. Setelah itu tabung diketuk-ketuk secara periodik untuk menyebarkan DNA dalam larutan. DNA dapat disimpan pada suhu -200C untuk menghindarkan terjadinya kontaminasi, sehingga DNA akan selalu dalam keadaan murni.

Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya > dari 35 µg DNA per mL darah. Dari 300 µL sediaan (buffy coat), hasil DNA yang diharapkan berkisar antara 5 sampai 10 mg. Pengukuran serapan DNA dilakukan pada panjang gelombang 260 nm (A 260). Pada A260 = 1, konsentrasi DNA adalah 50 mg/mL. Konsentrasi DNA dapat ditentukan dengan rumus:

Konsentrasi DNA (mg/mL) = A260 × 50 mg/mL

Pengenceran

DNA yang diperoleh sangat tergantung pada jumlah sel darah putih dalam sampel darah atau sumsum tulang. Jumlah sel darah putih dalam sampel bervariasi, tapi rata-rata terdapat 7 × 106/ mL darah. Setiap sel rata-rata mengandung 6 pikogram DNA. Hasil yang didapat mungkin lebih rendah, bila sampel darah dikumpulkan tanpa EDTA atau penyimpanannya tidak tepat, atau bila sampel disimpan lebih dari 5 hari sebelum digunakan dalam prosedur isolasi DNA ini.

Kemurnian DNA ditentukan dengan nilai indeks kemurnian. DNA yang murni memiliki indeks kemurnian > 1,75.

Indeks Kemurnian = A260 / A280

Bila indeks kemurnian < 1,75 menandakan, mungkin masih terdapat adanya protein pada saat proses pengendapan DNA, sehingga benag-benang kromosom masih bercampur dengan protein.

DNA genom yang diisolasi dapat digunakan untuk identifikasi DNA suatu organisme karena bersifat khas, baik dengan metode PCR (polymerase chain reaction) atau menggunakan enzim endonuklease restriksi (”DNA fingerprinting”). Hasil pemeriksaan dari kedua teknik tersebut kemudian dapat digunakan untuk diagnosis penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus atau bakteri, mendeteksi adanya mutasi gen yang menimbulkan penyakit keganasan, penyakit herediter, menentukan jenis kelamin prenatal serta sebagai alat bantu forensik dalam bidang kedokteran.

.

6 komentar: