ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON

ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON

(Manihot utilissiima Pohl)

1. Tujuan Praktikum

Dapat memahami dan dapat melakukan isolasi flavonoid dari daun ketela pohon.

Dapat memahami dan dapat melaksanakan analisis kualitatif golongan senyawa tersebut dengan metode kromatografi lapis tipis.

2. Dasar Teori Percobaan

Semua flavonoid, menurut strukturnya, merupakan senyawa induk flavon yang terdapat berupa tepung putih pada tumbuhan Primula, dan semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama. Saat ini dikenal sekitar 20 jenis flavonoid.

Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air. Mereka dapat diekstraksi dengan alkohol 70% dan tetap ada pada lapisan air setelah ekstrak dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila di tambah basa atau amoniak, jadi flavonoid mudah dideteksi pada kromatogram atau dalam larutan.

Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonyugasi dan karena itu menunjukan pita serapan kuat pada spektrum UV dan spektrum tampak. Flavonoid umumnya terdapat dalam tumbuhan, terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid.

Flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan berpembuluh tetapi beberapa kelas lebih tersebar daripada yang lainnya. Penyebaran flavonoid meliputi,

Golongan Tumbuhan	Flavonoid
Bakteri	Hampir tidak ada sama sekali
Fungi
Ganggang merah
Lumut hati	Sedikit tipe flavonoid, terutama 3-deoksiantosianin, glikoflavon
Equisetum	Flavonoid berstruktur sederhana, 3-deoksiantosian, flavon, flavonol, leukoantosianidin, kalkon dan flavanon.
Lycopodium
Paku-pakuan
Gymnospermae	Kebanyakan flavonoid, biasanya tipe sederhana, biflavonil
Angiospermae	Segala macam flavonoid, biflavonil jarang

Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran, jarang sekali dijumpai hanya flavonoid tunggal dalam jaringan tumbuhan. Disamping itu, sering terdapat campuran yang terdiri atas flavonoid yang berbeda kelas. Antosianin berwarna yang terdapat dalam daun bunga hampir selalu disertai oleh flavon dan flavonolol tanwarna.

Flavonoid mempunyai rumus umum, C₆C₃C₆.

Aktivitas biologi flavonoid antara lain,

- anti kanker : kuersetin, mirisetin

- anti oksidant : kuersetin, antosianidin, dan prosianidin

- anti inflamasi : apigenin, taksifolin, luteolin, kuersetin

- anti alergi : nobeletin, tangeretin

- anti hipertensi : prosianidin

- anti virus : amentiflavum, skutellarein, kuersetin

Klasifikasi flavonoid umumnya didasarkan atas inti molekul,

*Harbone membagi flavonoid kedalam kelompok

- Antosianin

- Proantosianidin

- Flavonol

- Flavon

- Khalkon dan auron

- Flavanon

- Glikoflavon

- Isoflavon

- Biflavonil

*Berdasarkan warna flavonoid

*Berdasarkan flavonoid major dan flavonoid minor

- flavonoid major : flavon, flavonol, biflavonil

- flavonoid minor : khalkon, dihidrokhalkon, auron, flavanon, flavononol dan isoflavon.

Hampir setiap tumbuhan tingkat tinggi menunjukkan pola khas glikosida flavon dan flafonol dalam daun atau bunga. Senyawa tersebut merupakan penanda taksom idel dalam pengkajian masalah penggolongan tumbuhan, penghibridaan, atau fitogeografi. Walaupun banyak yang dipelajari dengan membandingkan pola bercak flavonoid dalam kromatogram dua arah dari ekstrak 2 jenis tumbuhan yang berbeda, atau dari populasi tumbuhan, tetapi tetap perlu diidentifikasi komponen utama yang ada. Ini dapat dilakukan dengan menggunakan sederetan cara fitokimia sederhana, dan untuk mempelajari cara ini dianjurkan pertama-tama pada flavonoid yang sudah dikenal, yaitu rutin yang merupakan glikosida kuersetin.

Rutin atau kuersetin 3-rutinosida pertama kali diisolasi dari Fagopyrum esculentum dan sampai sekarang tumbuhan ini masih tetap digunakan. Tidak dapat diragukan lagi bahwa dari semua glikosida kuersetin, rutin paling luas penyebarannya dan mungki terdapat pada 25 % dari flora setempat. Sumber yang mudah diperoleh termasuk bunga Magnolia, Viola, Aesculus hippocastanum, Nicotiana tabacum (daun tembakau), Rheum, teh, dan Phaseolus vulgaris. Bahan tumbuhan yang diperoleh dari sumber tersebut di atas harus dikumpulkan da diekstraksi oleh etanol 95 % panas (jaringan segar) atau etanol 70 % (jaringan kering) selama 30 menit, lalu ekstrak dipekatkan sampai volumenya tinggal sedikit.

Kuersetin 3- rutinosida

Kuersetin merupakan salah satu flavonoid yang banyak terdapat di alam dan diketahui mampu menghambat enzim sitokrom P-450 yang berperan dalam metabolisme parsetamol. Hasil penelitian menunjukkan kadar parasetamol dalam darah tidak dipengaruhi oleh dosis kuersetin yang diberikan. Derajat nekrosis hati karena pemberian parasetamol dosis toksik lebih rendah pada pemberian kuersetin 750 mg/kg BB (p<0,05). Kuersetin dosis 750 mg/kg BB dapat menghambat aktivitas sitokrom P-450 yang tinggi karena parasetamol dosis toksik (p<0,05). Dari hasil penelitian dapat disimpulkan kuersetin dosis 750 mg/kg BB dapat menurunkan efek hepatotoksik parasetamol, dan menurunkan aktivitas enzim sitokrom P-450.

Pergeseran spektrum UV dan spektrum tampak pada rutin

Larutan Etanol	λmax (nm)			Pengaruh pada Spektrum	Diagnosis Struktur
	Pita I	Pita II	Pita III
Etanol	259	366 bh	363	Geser hipsokrom 12 nm dibandingkan dengan kuersetin (pita III 375 nm)	3-OH tersulih
Ditambah 2 tetes NaOH 2M	272	327	415	Geser batokrom 52 nm (pita III)	4’-OH bebas
Ditambah 2 tetes AlCl3 5%	275	303 bh	433	Geser batokrom 70 nm (pita III)	5-OH bebas
Ditambah serbuk NaOAc	271	325	393	Pergeseran 12 nm pada pita I	7-OH bebas
Ditambah NaOAc dan H3BO3	262	298	387	Geser batokrom 20 nm (pita III)	3’,4’-diOH bebas

3. Materi dan Metode

Alat dan Bahan

- Hot plate 1 buah

- Erlenmeyer 1000 ml 1 buah

- Batang pengaduk 2 buah

- Corong 2 buah

- Gelas kimia 100 ml 1 buah

- Water bath 1 buah

- Tabung reaksi 1 buah

- Lempeng KLT secukupnya

- Kapas secukupnya

- Alumunium Foil secukupnya

- Corong Pisah 250 ml 1 buah

- Cawan porselin 2 buah

- Pipa kapiler 2 buah

- Lampu UV-Vis 1 buah

- Serbuk daun singkong kering 40 gram

- Aquadest 300 ml

- Etanol 96% dingin secukupnya

- HCl 2 N 10 ml

- Dietil Eter 75 ml

- Metanol 2 ml

- Natrium Sulfat Anhidrat 3 gram

Prosedur Kerja

- 40 gram serbuk daun singkong kering ditimbang dan dimasukan kedalam Erlenmeyer 1000 ml

- Ditambahkan aquadest sebanyak 300 ml kedalam Erlenmeyer tadi, dipanaskan dengan hotplate selama 45 menit.

- Cairan disaring dengan menggunakan kapas dengan bantuan corong, dan selanjutnya disaring kembali dengan kertas saring.

- Dimasukan kedalam lemari pendingin hingga terbentuk kristal rutin.

- Jika rutin telah terbentuk, saring larutan dengan menggunakan kertas saring.

- Endapan yang didapat dicuci dengan etanol dingin, endapan terdapat dan kertas saring dikeringkan dengan oven pada suhu 40⁰ C selama 3 jam.

- Endapan diambil dengan spatel kecil, dan dilarutkan dalam 2 ml campuran metanol dan air sama banyak (sari I).

- Sisa padatan dimasukan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml HCl 2 N.

- Diatas tabung ditempatkan corong berisi kapas untuk mengurangi penguapan. Selanjutnya tabung tersebut dipanaskan dalam waterbath selama 1 jam.

- Cairan hasil hidrolisis tersebut dimasukan kedalam corong pisah. Ditambahkan dietileter sebanyak 25 ml dikocok dengan hati-hati, kedua lapisan yang terbentuk dipisahkan.

- Lapisan air asamnya dikocok lagi dengan dietileter sebanyak 25 ml selama 3 kali pengocokan.

- Lapisan eter hasil ekstraksi 1,2 dan 3 dicampurkan lalu disaring melalui kertas saring yang berisi 3 gram Natrium sulfat anhidrat. Cairan yang diperoleh lalu diuapkan dalam lemari asam.

- Residu yang diperoleh dilarutkan dengan 2 ml methanol (Sari II)

- Totolkan sebagai titik A adalah Sari I dan titik B adalah Sari II.

- Eluasi dengan n-heksan – etilasetat dengan perbandingan 7:3.

- Hasil yang diperoleh disemprot dengan penampak bercak uap amoniak.

- Dan dibaca dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 254 dan 366 nm.

4. Hasil Pengamatan

n Massa kristal rutin (tidak murni) yang didapat dari 40 gram daun singkong adalah,

Massa vial + rutin = 10,9312 gr

Massa vial kosong = 7,9043 gr

Massa kristal rutin adalah 10,9312 gr - 7,9043 gr = 3,0269 gr

n Rendemen = [3,0269 gram / 40 gram] x 100%= 7,56%

n Hasil pengamatan lempeng KLT dengan sinar UV panjang gelombang 254 nm

Didapatkan Rf sebesar = 2,6 / 4,1 = 0,63

Nilai Rf untuk aglikon (kuersetin)

5. Pembahasan

Pada praktikum kali ini adalah untuk mengisolasi rutin (flavonoid-3-glikosida) sebagai salah satu jenis glikosida flavonoid (glikosida flavonol) yang terkandung dalam daun singkong/ketela pohon. Glikosida flavonoid termasuk rutin merupakan salah satu metabolit sekunder yang bersifat polar, termasuk kedalam kelompok glikosida O (molekul gula berikatan dengan O-aglikon). Rutin daun singkong (satu zat aktif) sebagai bahan obat-obatan dan kosmetik, serta jadi zat pengatur tumbuh tanaman.

Karena sifatnya yang polar maka pengisolasian rutin dilakukan dengan penggunaan pelarut polar yaitu air, dengan penggunaan air yang kemudian dipanaskan membuat semua senyawa polar tertarik bersama filtrate. Hal ini merupakan salah satu kerugian penggunaan air sebagai pelarut karena, banyak sekali komponen-komponen polar yang dapat larut bersama air.

Filtrate yang diperoleh diuapkan hingga didapat filtrate kental dan disimpan dalam lemari pendingin untuk mempercepat pembentukan kristal rutin dan mencegah terjadinya penjamuran. Karena dengan media air memungkinkan timbulnya jamur atau bakteri jika disimpan di suhu ruang.

Endapan yang diperoleh disaring dan dicuci dengan menggunakan etanol dingin dengan maksud agar kemurnian filtrate bertambah dan terbebas dari pengotor-pengotor yang tidak ingin diisolasi, tetapi dengan pencucian ini tidak menyebabkan kristal larut.

Sebagian dari endapan ditambahkan HCl untuk proses hidrolisis dimaksudkan agar glikosida flavonoid rutin terhidrolisis sehingga aglikon flavonoid (kuersetein) terpisah dengan molekul gulanya. Kuersetin ini termasuk aglikon flavonoid (zat bukan gula) yang berdasarkan strukturnya dapat digolongkan menjadi flavonol, kuersetin mempunyai khasiat sebagai antiinflamasi, antikanker dan antioksidant.

Setelah dihidrolisis, larutan dipartisi dengan pelarut eter dengan menggunakan corong pisah, eter digunakan karena memiliki kepolaran yang sama dengan aglikon flavonoid (kuersetin). Maka seluruh senyawa kuersetin akan tertarik kedalam pelarut eter, ekstraksi dilakukan sebanyak 3 kali untuk memaksimalkan pengisolasian. Seluruh fase eter yang dicampur disaring dengan tambahan Na sulfat anhidrat agar molekul air yang ada dalam eter dapat tertarik, sehingga larutan benar-benar murni eter dan aglikon flavonoid. Fase eter ini diuapkan dan selanjutnya residu yang ada ditambahkan methanol sebagai pelarut (sari II) untuk dilakukan KLT.

Proses hidrolisis rutin menjadi kuersetin berjalan menurut reaksi berikut:

HCl

Hidrolisis

+

Rutin Kuersetin Glukosa

Sisa endapan yang tidak dihidrolisis juga dilarutkan dengan methanol untuk selanjutnya di KLT bersama dengan sari II, dan Rf yang dihasilkan dapat dibandingkan dan dapat terlihat proses hidrolisis berjalan dengan sempurna atau tidak.

Sari I dan sari II dilakukan pengujian dengan KLT menggunakan eluen etanol 96%. Dengan digunakannya eluen yang bersifat polar maka senyawa polar akan terelusi lebih dulu dan memiliki Rf yang lebih tinggi, dibandingkan dengan senyawa non-polar ataupun semipolar. Pada KLT ini yang diuji adalah senyawa polar yaitu glikosida flavonoid (rutin) dan senyawa non-polar yaitu aglikon glikosida (kuersetin).

Dari hasil KLT ini, kedua senyawa terelusi dan pada titik B ada senyawa yang tidak terelusi dan tetap berada pada dasar lempeng KLT, hasil ini menunjukan adanya kuersetin yang sudah terpisah dari rutin, tetapi karena kedua spot terelusi maka hidrolisis yang dilakukan tidak berjalan dengan sempurna, ataupun ada pengotor lainnya yang terelusi dengan pelarut polar.

Pada penelitian sebelumnya terhadap pemeriksaan kadar rutin pada daun singkong (Manihot utilissima Pohl.) muda, tua dan kuning. Secara KLT-spektrofotodensitometri kadar rutin daun singkong muda adalah 0,71% (b/b), daun singkong tua 0,35%(b/b) dan daun singkong kuning 0,16%(b/b) dan secara gravimetri kadar rutin daun singkong muda adalah 0,56% (b/b), daun singkong tua 0,32%(b/b) dan daun singkong kuning tidak terdeteksi. Telah dilakukan pula isolasi rutin dari daun singkong muda dengan cara maserasi dengan natrium hidroksida 1% dan rutin yang didapat dari maserasi ini adalah 0,027% (b/b).

Pada praktikum kali ini digunakan daun singkong yang sudah agak tua sehingga kadar yang didapat tidak maksimal. Dan untuk terbentuknya kristal rutin dibutuhkan waktu yang sangat lama sekali kurang lebih selama 2 minggu. Dan kristal rutin yang terbentuk sangat sedikit sekali, dan tercampur dengan endapan lainnya.

6. Kesimpulan

Rutin merupakan salah satu jenis glikosida flavonoid yang bersifat polar, sehingga dapat diekstraksi dengan pelarut polar, seperti air, methanol atau etanol. Filtrate yang didapat dari hasil penyarian didinginkan untuk mempercepat pembentukan kristal.

Pemisahan aglikon dan glikosidanya dapat dilakukan dengan hidrolisis asam, seperti menggunakan HCl. Akan didapat hasil berupa kuersetin dan glukosa dari hidrolisis rutin.

Analisa dari aglikon dan glikosida ini dapat dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis, dan menggunakan eluen tertentu sesuai dengan kepolaran senyawa yang dianalisa.

Daftar Pustaka

Harbone, J.B. 1987. Metode Fitokimia penuntun cara modern menganalisis tumbuhan terbitan kedua. Bandung: ITB.

Markham, K.R. 1988 .Cara mengidentifikasi Flavonoid. Bandung: ITB.

Sekolah Farmasi ITB http://bahan-alam.fa.itb.ac.id